甜菜液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白BvNHX基因克隆及其表达载体构建

题名	甜菜液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白BvNHX基因克隆及其表达载体构建
作者	焦琦
学位类型	硕士
导师	伍国强
答辩日期	2017
学位授予单位	兰州理工大学
学位名称	硕士
学位专业	生物化学与分子生物学
关键词	甜菜耐盐性液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白 BvNHX 超表达 RNA干扰液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白
摘要	土壤盐碱化是影响农作物质量和产量的非生物胁迫之一。在盐胁迫条件下液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白对植物的生存具有重要的作用,可以将细胞质中过多的Na+区域化至液泡中,以减轻对细胞质的离子毒害,并维持细胞中离子与渗透势的平衡,提高植物的耐盐性。因此,克隆液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因并对其功能进行研究变得非常有必要。本文以甜菜(Beta vulgaris L.)为材料,克隆甜菜液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因BvNHX的全长cDNA,构建其超表达载体和RNAi载体,初步探讨该基因在甜菜Na+区域化中的功能,取得了如下结果:(1)在200~300 mmol/L NaCl处理下,相比与四倍体(TY03410)二倍体(TY03209)地上部与根部积累较多Na+,而K+的含量没有显著性差异,在50~300 mmol/L NaCl处理下两者的K+/Na+没有显著性差异,100 mmol/L NaCl处理使二倍体(TD85ms)的鲜重相对生长率高于四倍体(TY03410),但两者K+/Na+在50~300 mmol/L NaCl处理下没有显著性差异,可见四倍体与二倍体的耐盐性没有显著性差异;在100 mmol/L NaCl处理下,四倍体(TY03410)和二倍体(TD85ms)地上部与根部干重、鲜重和Na+含量随着处理时间的增加呈递增趋势,但根部在处理72 h、地上部处理120 h后两者K+/Na+没有显著性差异。(2)根据已知其它植物液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因设计简并性引物,利用RACE方法,克隆得到甜菜液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白BvNHX基因的全长cDNA,其全长为2284 bp,包括1653bp的开放阅读框(ORF),19 bp的5’非翻译区(5’UTR),以及612 bp的3’非翻译区(3’UTR),其中包含25bp的poly(A)尾巴,编码552个氨基酸,推测分子量为61.34 kD,等电点为6.609。含有12个跨膜结构域,位于第三个跨膜区的氨氯吡嗪咪(Amiloride)结合位点LFFYLLPPI与其它物种有高的同源性。(3)通过对甜菜液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因BvNHX全长序列的分析,选取大小为1653bp的一段序列做为目的序列,设计带有酶切位点的特异性引物,采用RT-PCR的方法克隆得到该片段,成功构建BvNHX超表达载体pCAMBIA1302-BvNHX,利用冻融法转化至农杆菌GV3101。(4)通过对23种植物液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白编码基因核苷酸序列比对,选择保守性高的、长度为500 bp的片段作为RNAi片段,设计带有酶切位点的特异性引物,用于扩增构建甜菜液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白BvNHX基因干扰载体的正、反义片段,以中间载体pHANNIBAL和表达载体pART27为基础,利用酶切连接法成功构建BvNHX基因的干扰载体PARB。(5)采用实生苗侵染法,获得阳性干扰植株,利用PCR法检测pARB是否整合至植物基因组中,采用RT-PCR分析BvNHX基因是否沉默,结果表明,12株苗的BvNHX不同程度受到干扰。
其他摘要	In this study, the full-length cDNA of the tonoplat Na+/H+ antiporter gene BvNHX was cloned from sugar beet（Beta vulgaris L.）, On this basis, we constructed the overexpression vector and RNAi expression vector of the tonoplat Na+/H+ antiporter gene BvNHX.
页数	78
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语种	中文
收录类别	CNKI
中图分类号	Q943.2
学号	142071010003
文献类型	学位论文
条目标识符	https://ir.lut.edu.cn/handle/2XXMBERH/92375
专题	兰州理工大学
作者单位	兰州理工大学
第一作者单位	兰州理工大学
推荐引用方式 GB/T 7714	焦琦. 甜菜液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白BvNHX基因克隆及其表达载体构建[D]. 兰州理工大学,2017.