可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肽片段及验证方法

	可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肽片段及验证方法
	马建忠; 肖成斌; 马燕林; 王永刚; 张伟杰
	2019-05-21
专利权人	甘肃中科博瑞生物工程有限公司
公开日期	2019-05-21
授权国家	中国
专利类型	授权发明
摘要	本发明提供了一种可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肽片段及其验证方法，通过在酵母菌单杂交系统中，对拟南芥AtDPBF4/EEL进行双向缺失突变分析，发现了可在酵母菌细胞中激活基因转录的两个多肽片段AD1和AD2；体外合成AD1和AD2的编码区序列，连接至拟南芥原生质体瞬间表达分析的效应载体pHQEff，重组质粒分别命名为pHQEff‑AD1和pHQEff‑AD2；拟南芥原生质体瞬间表达分析结果表明，AD1和AD2均可激活报告基因(GUS)的表达。本发明多肽片段AD1和AD2的发现为进一步构建抗干旱、耐盐碱转基因植物提供了基础，对基因工程作物的培育和改良具有重要的指导意义。
申请日期	2015-07-01
优先权日	2015-07-01
预估到期日	2035-07-01
语种	中文
专利状态	授权;权利转移
申请号	CN201510376978.2
公开（公告）号	CN105198975B
IPC 分类号	C07K14/415 ; C12N15/82
专利代理人	刘芬豪
代理机构	杭州华进联浙知识产权代理有限公司
CPC分类号	C07K14/415 ; C12N15/8206
权利要求	1.一种可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肽片段，其特征在于，多肽片段为AD2多肽片段，所述AD2多肽片段如SEQ ID NO:2所示。 2.权利要求1所述多肽片段的验证方法，其特征在于，包括以下步骤：； (1)利用PCR技术体外扩增AtDPBF4/EEL基因形成一系列缺失突变体，扩增的缺失突变体分别连接至酵母菌表达载体pGBKT7，分别将空载的pGBKT7质粒和上述重组质粒转化酵母菌Y187菌株，对各个突变体进行转录激活活性分析； (2)根据在酵母菌系统中的AtDPBF4/EEL缺失突变分析的结果，合成3’末端相互覆盖的DNA片段，通过PCR技术体外扩增出完整的AD2的编码区序列，将扩增产物连接至拟南芥叶肉原生质体瞬间表达分析效应载体pHQEff，将重组质粒命名为pHQEff-AD2； (3)以pHQEff作为阴性对照，pHQRep-6作为报告基因载体，利用上述重组质粒pHQEff-AD2进行拟南芥叶肉原生质体瞬间表达分析，判断AD2多肽片段在植物细胞中是否具有激活转录的活性；所述PCR技术扩增完整的AD2的编码区序列所用引物为： AD2上游引物：5’-CTGAATTCAACATAGCT TCAAATGGGCAATG-3’ AD2下游引物：5’-CTGGATCCTTAAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3’；在步骤(1)中，所述缺失突变体包括D1至D11缺失突变体；所述重组质粒分别命名为pGBKT7-D1、pGBKT7-D2、pGBKT7-D3、pGBKT7-D4、pGBKT7-D5、pGBKT7-D6、pGBKT7-D7、pGBKT7-D8、pGBKT7-D9、pGBKT7-D10、pGBKT7-D11；其中，所述PCR技术体外扩增AtDPBF4/EEL的缺失突变体基因D1所用引物为： D1上游引物:5’-CGGAATTCCACTTAGGAAGTTCTGGAAAACCAC-3’ D1下游引物:5’-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3’ 所述PCR技术扩增D2所用引物为： D2上游引物:5’-CGGAATTCCTTGTTCGTCAGGGAAGCTTGACGTTAC-3’ D2下游引物:5’-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3’ 所述PCR技术扩增D3所用引物为： D3上游引物:5’-CGGAATTCACTACTACTACTCATAAGCAGCCTAC-3’ D3下游引物:5’-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3’ 所述PCR技术扩增D4所用引物为： D4上游引物:5’-CGGAATTCTTGTTGAGAGCTGGTGTAGTGACTGAG-3’ D4下游引物:5’-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3’ 所述PCR技术扩增D5所用引物为： D5上游引物:5’-CGGAATTCAACATAGCTTCAAATGGGCAATGGGTTG-3’ D5下游引物:5’-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3’ 所述PCR技术扩增D6所用引物为： D6上游引物:5’-CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3’ D6下游引物:5’-CGGGATCCAGGCGCTTGTGGTGTATCCGATAATC-3’ 所述PCR技术扩增D7所用引物为： D7上游引物:5’-CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3’ D7下游引物:5’-CGGGATCCAACAACATTTTCTTGAGGGACTACTG-3’ 所述PCR技术扩增D8所用引物为： D8上游引物:5’-CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3’ D8下游引物:5’-CGGGATCCTCTCCAGACCTCATCAACAGTC-3’ 所述PCR技术扩增D9所用引物为： D9上游引物:5’-CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3’ D9下游引物:5’-CGGGATCCTCGAGGTAACGTCAAGCTTCCCTGAC-3’ 所述PCR技术扩增D10所用引物为： D10上游引物:5’-CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3’ D10下游引物:5’-CGGGATCCTTCCTCAGCTGGTGGCAAGACAGTC-3’ 所述PCR技术扩增D11所用引物为： D11上游引物:5’-CGGAATTCATGGGTTCTATTAGAGGAAACATTG-3’ D11下游引物:5’-CGGGATCCAGAACTTCCTAAGTGGGATTGAAC-3’。
引用专利	CN102060919A
被引用专利数量	0
简单法律状态	有效
文献类型	专利
条目标识符	https://ir.lut.edu.cn/handle/2XXMBERH/109323
专题	兰州理工大学
推荐引用方式 GB/T 7714	马建忠,肖成斌,马燕林,等. 可激活酵母菌和植物细胞基因表达的多肽片段及验证方法[P]. 2019-05-21.