一种抑制基因水平转移的方法

	一种抑制基因水平转移的方法
	王永刚; 杨光瑞; 王玲; 陈凯; 马建忠; 冷非凡
	2022-03-04
专利权人	兰州理工大学
公开日期	2022-03-04
授权国家	中国
专利类型	授权发明
摘要	本发明公开了一种抑制基因水平转移的方法，涉及分子生物学领域及基因工程领域。本发明公开的抑制基因水平转移的方法，其包括：将目标外源质粒与loiP基因敲除的感受态宿主细胞混合。通过将宿主细胞的loiP基因敲除，降低转化率，该方法具有转化效率降低显著的特点。相对于野生型宿主细胞，loiP基因敲除的宿主细胞对质粒pUC19的转化效率降低了3.33倍，对质粒pET‑32a的转化效率降低了8.38倍，对质粒p1304的转化效率降低了2.75倍。该方法极大地降低宿主细胞对外源质粒吸收能力，对抵制微生物抗药性有十分重要的意义。
申请日期	2018-07-16
优先权日	2018-07-16
预估到期日	2038-07-16
语种	中文
专利状态	授权
申请号	CN201810774970.5
公开（公告）号	CN108913711B
IPC 分类号	C12N15/70 ; C12N15/90
专利代理人	肖丽
代理机构	北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙)
CPC分类号	C12N9/52 ; C12N15/70 ; C12N15/902 ; C12Y304/24004
权利要求	1.一种抑制基因水平转移的方法，其特征在于，其包括：质粒转化步骤；所述质粒转化步骤包括：将目标外源质粒与loiP基因敲除的感受态宿主细胞混合；所述感受态宿主细胞为采用CaCl2法制备的感受态大肠杆菌。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在质粒转化步骤之前，所述方法包括：loiP基因敲除步骤；所述loiP基因敲除步骤包括：将打靶片段与感受态的野生型宿主细胞混合；所述打靶片段的两端含有与loiP基因同源的同源臂序列。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述打靶片段还含有筛选标记基因。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述筛选标记基因为抗生素抗性基因。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗生素抗性基因选自卡那霉素抗性基因（npt II）、四环素抗性基因（tetR）、氯霉素抗性基因(cat)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)和潮霉素抗性基因(hpt)。 6.根据权利要求2-5任一项所述的方法，其特征在于，所述打靶片段的碱基序列如SEQID NO.1所示。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在loiP基因敲除步骤之前，所述方法还包括：打靶片段扩增步骤；所述打靶片段扩增步骤包括：以含有卡那霉素抗性基因的质粒为模板，以SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物进行PCR扩增。 8.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，在loiP基因敲除步骤之后，所述方法还包括：阳性重组子筛选步骤和筛选标记基因去除步骤；所述阳性重组子筛选步骤包括：用检测筛选标记基因的引物鉴定出阳性重组子；所述筛选标记基因去除步骤包括：将可编码重组蛋白FLP的质粒导入所述阳性重组子以删除筛选标记基因。 9.根据权利要求2-5任一项所述的方法，其特征在于，loiP基因的碱基序列如SEQ IDNO.6所示。
引用专利	US20100055748A1
被引用专利数量	0
简单法律状态	有效
文献类型	专利
条目标识符	https://ir.lut.edu.cn/handle/2XXMBERH/108472
专题	兰州理工大学
推荐引用方式 GB/T 7714	王永刚,杨光瑞,王玲,等. 一种抑制基因水平转移的方法[P]. 2022-03-04.